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慢性HIV感染患者CD8+T淋巴细胞CD38、单核细胞CD169和B淋巴细胞激活因子的表达水平及应用价值研究

作者:感染病学分会 日期:2018-08-07 浏览量:127

HIV进入人体后,机体的免疫系统不能完全清除病毒,长期持续性病毒刺激,导致免疫细胞进行性损伤和异常免疫激活。免疫异常活化是疾病进展的重要因素,与患者预后息息相关[1]。因此,判断HIV感染患者免疫活化状态具有重要的临床意义。有文献报道,慢性HIV感染患者中,HIV抗原可导致T细胞、单核-吞噬细胞和B细胞协同信号增加,诱导产生大量细胞因子,进而导致免疫细胞活化标志物CD38、CD169和B细胞激活因子(BAFF)表达明显上调[2,3,4]。表达CD38的CD8+ T淋巴细胞其分泌细胞因子功能下降,且细胞增殖能力和细胞毒作用明显受损,与疾病进展相关,是目前评价慢性HIV感染患者免疫活化的主要标志物。CD169为一种黏附分子,其主要功能为识别含有唾液酸的糖链结构,促进细胞间结合,介导细胞间信号转导,参与机体免疫应答[5]。HIV通过包膜糖蛋白120上的唾液酸残基结合单核/吞噬细胞类细胞膜表面的CD169促进HIV在免疫细胞间传染,表达CD169的HIV感染的单核/吞噬细胞与二级淋巴组织内T、B、NK等免疫细胞相互接触,激活T、B、NK等免疫细胞,CD169表达与HIV患者免疫细胞异常激活、HIV在机体内传播和复制相关[6]。BAFF是肿瘤坏死因子超家族配体成员,主要由活化的单核-巨噬细胞、树突样细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞等合成和分泌[7],其主要功能为调控B细胞存活、增殖和抗体产生并参与T淋巴细胞功能调节。HIV感染机体时,淋巴细胞、单核-吞噬细胞及树突样细胞等免疫细胞受病毒刺激而异常活化,导致BAFF分泌增加,BAFF不仅与HIV病毒复制、T淋巴细胞功能相关,还与HIV患者B细胞病理性改变相关[4]。为了综合评价各指标在慢性HIV感染中的应用价值,本研究选取未经抗病毒治疗慢性HIV患者,分析其外周血CD8+ T淋巴细胞CD38、单核细胞CD169和BAFF水平,现将研究结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2017年1月至2017年12月经浙江省疾病预防控制中心确诊、在册资料齐全的门诊未进行抗病毒治疗的慢性HIV感染患者50例,其中男性40例,女性10例,年龄为(37.4±14.9)岁。纳入标准[8]:HIV抗体确认阳性且发现时间>12个月。排除标准:急性期HIV感染患者;存在严重合并症、机会感染、结核、梅毒和病毒性肝炎的患者。根据CD4+ T淋巴细胞数量,将慢性HIV感染患者分为<200个/μL即艾滋病期组(n=27)和≥200个/μL即无症状期组(n=23)。同时选取30名健康体检者为对照组,其中男性22例,女性8例,年龄(36.8±13.6)岁。所有患者及健康体检者均签署知情同意书,本研究获得医院伦理委员会的审核和批准(批号:201701019)。

1.2 仪器和试剂

FACS CantoⅡ流式细胞分析仪及原装CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD169试剂(美国BD公司); Sysmex-2100全自动血细胞分析仪及原装配套试剂(日本Sysmex公司);美国ABI 7500实时荧光定量PCR仪及达安基因HIV-1核酸测定试剂盒,Andy gene公司人BAFF酶联免疫分析定量试剂盒。仪器均定期用配套校准物校准并用质控品进行质量控制。

1.3 方法

1.3.1 样本采集

采集慢性HIV感染患者和健康体检者静脉血5 mL,其中EDTA-K2抗凝2 mL,2 h内完成上机检测分析,肝素抗凝血3 mL离心收集血浆,-80℃保存。

1.3.2 血常规检测

取EDTA-K2抗凝2 mL,混匀上Sysmex-2100全自动血细胞分析仪检测,记录外周血淋巴细胞和单核细胞绝对值。

1.3.3 流式细胞检测

取所有对象外周血100 μL加入目标荧光标记抗体各10 μL,室温混匀标记20 min,加入溶血素破坏红细胞10 min,300×g离心5 min弃上清液沥干,再用缓冲液2 mL洗涤1次,200×g离心5 min弃上清液沥干,再加入缓冲液200 μL,混匀上机进行分析。记录CD4+ T淋巴细胞、CD8+ CD38+ T淋巴细胞和CD169+ CD14+细胞比例,乘以外周血淋巴细胞绝对值和单核细胞绝对值获得CD4+ T淋巴细胞、CD8+CD38+细胞和CD169+CD14+细胞绝对值。

1.3.4 HIV病毒载量检测

将待测样本与阴性质控品、HIV-1强阳性、HIV-1临界阳性质控品按照试剂说明书进行核酸提取,取PCR反应管将各组试剂组分充分混合,混合好后进行短时离心至管底,之后将30 μL扩增体系分装到PCR管中,在上述HIV-1反应管中加入已提取的核酸20 μL,盖紧管盖,4 672×g离心数秒移至扩增检测区,放于ABI 7500实时荧光定量PCR仪设置反应参数进行检测,自动获取分析结果,记录结果。

1.3.5 BAFF检测

-80℃保存血浆快速解冻后混匀待检,在酶包被板上加入浓度为3 000、2 000、1 000、500、250 ng/L标准品用于制作标准曲线,并设立空白对照;先在酶包被板上各个测试孔中加入样品稀释液40 μL,再加入标本10 μL,混匀,封板37℃水浴30 min,后甩干液体,用事先配好的洗涤液,洗板3次并拍干,随后每孔加入酶标试剂50 μL,空白孔除外;封板37℃水浴30 min,后甩干液体,用事先配好的洗涤液,洗板3次并拍干;分别加入显色剂A和B各50 μL混匀,避光15 min,再加入终止液50 μL终止反应,以空白调零,450 nm波长测量各孔吸光度值,参照标准曲线得出各个标本的BAFF浓度。

1.3.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析。定性数据使用χ2检验,正态分布的数据以±s表示,多组间均数比较用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK检验;两组间相关性应用Pearson相关进行分析;诊断效率用受试者工作特征(ROC)曲线分析,诊断效率运用Z检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

艾滋病期组、无症状期组和健康对照组三组性别构成和年龄分布相比,差异均无统计学意义(P值均>0.05)。慢性HIV感染患者艾滋病期组、无症状期组两组感染时间无统计学意义(t=1.03,P>0.05),病毒载量具有统计学意义(t=5.30,P<0.05),见表1。

表1  不同CD4+T淋巴细胞水平慢性HIV感染患者一般资料比较(±s)

2.2 CD38+ CD8+ T淋巴细胞、CD169+单核细胞比例和BAFF水平比较

三组CD38+ CD8+ T淋巴细胞计数和比例比较,差异均具有统计学意义(F=4.45和18.95,P<0.05)。其中,艾滋病期组和无症状期组的CD38+ CD8+ T淋巴细胞计数和比例均明显高于健康对照组(P<0.05),艾滋病期组和无症状期组CD38+ CD8+ T淋巴细胞计数和比例比较,差异均无统计学意义(P值均>0.05)。三组CD169+单核细胞计数和比例比较,差异具有统计学意义(F=16.62和35.27,P<0.05)。艾滋病期组和无症状期组的CD169+单核细胞计数和比例均明显高于健康对照组(P值均<0.05),艾滋病期组和无症状期组CD169+单核细胞计数比较,差异无统计学意义(P >0.05),而艾滋病期组的CD169+单核细胞比例明显高于无症状期组(P<0.05)。三组BAFF水平比较,差异具有统计学意义(F=55.47,P<0.05)。艾滋病期组和无症状期组的BAFF水平均明显高于健康对照组(P值均<0.05),艾滋病期组的BAFF水平明显高于无症状期组(P<0.05),见表2。

表2  不同CD4+T淋巴细胞水平慢性HIV感染患者各指标的比较(±s)

2.3 CD38+ CD8+ T淋巴细胞、CD169+单核细胞比例和BAFF水平同CD4+ T淋巴细胞及HIV病毒载量相关性分析

慢性HIV感染患者CD38+CD8+T淋巴细胞、CD169+单核细胞比例和BAFF浓度与CD4+ T淋巴细胞均呈负相关(r=-0.567、-0.706和-0.56,P值均<0.05),而与HIV病毒载量均呈正相关(r=0.315、0.392和0.607,P值均<0.05)。

2.4 采用ROC曲线下面积对血液中CD38+ CD8+ T淋巴细胞、CD169+单核细胞比例和BAFF浓度诊断艾滋病期的效能评估

将艾滋病期组设为正类,无症状期组设为负类,建立ROC曲线分析CD38+ CD8+ T淋巴细胞、CD169+单核细胞比例和BAFF水平诊断艾滋病期的效能。结果显示,CD38+ CD8+ T淋巴细胞比值曲线下面积(AUC)为0.668(95%CI 0.518~0.818),约登指数为0.306;CD169+单核细胞比例AUC为0.795(95% CI 0.668~0.921),约登指数为0.541;BAFF水平AUC为0.881(95% CI 0.790~0.972),约登指数为0.611。三种指标均可用于判断艾滋病期(P<0.05或<0.01)。曲线下面积间比较,三种指标之间均无统计学意义(P值均>0.05),见图1和表3。

表3  各指标在慢性HIV感染患者艾滋病期的分期价值




图1  各指标在提示慢性HIV感染患者艾滋病期的受试者工作特征曲线分析

3 讨论

慢性HIV感染患者由于长期持续性病毒复制,HIV抗原水平不断增高,更多的免疫细胞被激活,导致机体免疫功能进一步受损,抗病毒能力下降,同时激活的免疫细胞又为病毒复制提供更多的宿主细胞,有利于病毒传播和复制,两者相辅相成,相互促进。因此,免疫细胞活化状态与病毒载量、机体免疫功能和疾病进展高度相关[9,10]。

慢性HIV感染从病程上分为无症状期和艾滋病期。其中无症状期持续时间较长且个体差异较大,时间跨度长短不一。艾滋病期是HIV的最终阶段,易发各种机会感染和肿瘤,CD4+ T细胞<200个/μL是目前判断艾滋病期的主要标准[8]。本研究根据CD4+ T细胞计数将门诊未抗病毒治疗的慢性HIV感染患者分为艾滋病期组和无症状期组,并对两组的各个指标进行分析。结果显示,艾滋病期组患者的CD38+CD8+ T淋巴细胞的数量和比例较无症状期升高,但差异均无统计学意义,这可能与感染初期CD8+ T的激活水平快速增高,CD4+ T细胞计数减少相关,随着感染时间的延长,CD8+ T的激活水平增幅减小,CD4+ T细胞计数却加速减少,导致两者相关性降低。艾滋病期组CD169+单核细胞数量较无症状期增加,但差异无显著性,这可能与CD169+单核细胞数量是由CD169+单核细胞比例乘外周血单核细胞绝对值获得,而两组外周血单核细胞绝对值间无显著性差异有关。CD169+单核细胞比例和BAFF显著升高,差异具有统计学意义,其中尤以BAFF差异更为明显,与Carbone等[11]报道的低CD4+ T细胞水平时BAFF分泌明显增加相一致,这可能与艾滋病期患者免疫细胞活化程度增高及B细胞的病理性改变加剧有关。CD4+ T细胞计数和病毒载量是目前判断疾病进展、疗效和预后的主要指标[8]。本研究对免疫活化状态指标CD38+CD8+ T淋巴细胞、CD169+单核细胞及BAFF水平与病毒载量、CD4+ T细胞数量进行了相关性研究,以评估上述免疫活化指标在HIV疾病进展中的价值。结果表明,HIV慢性感染患者各指标同HIV病毒载量呈显著正相关,各指标同CD4+ T细胞呈显著负相关。以上结果表明,CD8+ T淋巴细胞CD38和单核细胞CD169及BAFF表达水平与HIV疾病进展相关。

为了进一步探讨本研究中各指标在慢性HIV感染疾病分期中的价值,进行了ROC曲线分析。结果显示,3个指标均有助于艾滋病期的判断,但3个指标间均无统计学意义。CD38+CD8+ T淋巴细胞和CD169+单核细胞比例分别取52.75%和59.5%为最佳诊断界值,两者均具有一定的敏感度,但特异度均较差;BAFF的最佳诊断界值为1 281.5 ng/L,具有较好的灵敏度和特异度,同时3个指标的约登指数显示,BAFF的约登指数数值最大,表明BAFF与临床符合率最高,这可能与BAFF异常升高引起调控B细胞存活、增殖和生成抗体功能紊乱,导致HIV中和抗体生成减少、B细胞正向调控CD4+T淋巴细胞作用减弱,加速CD4+ T细胞减少,与疾病进展有关[12] 。

综上所述,慢性HIV感染患者免疫活化指标CD38+CD8+ T淋巴细胞、CD169+单核细胞比例和BAFF明显升高,与CD4+ T细胞数量和病毒载量相关,CD169+单核细胞比例和BAFF指标艾滋病期较无症状期均明显增高,可作为潜在预测疾病进展的辅助指标。

利益冲突利益冲突 无

参考文献

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